См. Документы Министерства сельского хозяйства Российской Федерации
МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ПРИКАЗ
от 22 марта 2019 г. N 126
ОБ УТВЕРЖДЕНИИ МЕТОДИКИ
ПРОИЗВОДСТВА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ
ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА КОРМОВ И КОРМОВЫХ ДОБАВОК ДЛЯ ЖИВОТНЫХ,
А ТАКЖЕ КОРМОВ И КОРМОВЫХ ДОБАВОК ДЛЯ ЖИВОТНЫХ, ПОЛУЧЕННЫХ
С ПРИМЕНЕНИЕМ ТАКИХ ОРГАНИЗМОВ ИЛИ СОДЕРЖАЩИХ
ТАКИЕ ОРГАНИЗМЫ
В соответствии с пунктом 13 Правил государственной регистрации генно-инженерно-модифицированных организмов, предназначенных для выпуска в окружающую среду, а также продукции, полученной с применением таких организмов или содержащей такие организмы, включая указанную продукцию, ввозимую на территорию Российской Федерации, утвержденных постановлением Правительства Российской Федерации от 23 сентября 2013 г. N 839 (Собрание законодательства Российской Федерации, 2013, N 39, ст. 4991; 2014, N 25, ст. 3317; 2017, N 28, ст. 4145; 2018, N 6, ст. 896; N 41, ст. 6260), приказываю:
Утвердить прилагаемую Методику производства молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства кормов и кормовых добавок для животных, а также кормов и кормовых добавок для животных, полученных с применением таких организмов или содержащих такие организмы.
Министр
Д.Н.ПАТРУШЕВ
Утверждена
приказом Минсельхоза России
от 22 марта 2019 г. N 126
МЕТОДИКА
ПРОИЗВОДСТВА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ
ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ
ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА КОРМОВ И КОРМОВЫХ ДОБАВОК ДЛЯ ЖИВОТНЫХ,
А ТАКЖЕ КОРМОВ И КОРМОВЫХ ДОБАВОК ДЛЯ ЖИВОТНЫХ, ПОЛУЧЕННЫХ
С ПРИМЕНЕНИЕМ ТАКИХ ОРГАНИЗМОВ ИЛИ СОДЕРЖАЩИХ
ТАКИЕ ОРГАНИЗМЫ
I. Общие положения
1. Настоящая Методика устанавливает порядок проведения молекулярно-генетического исследования генно-инженерно-модифицированных организмов, используемых для производства кормов и кормовых добавок для животных, а также кормов и кормовых добавок для животных, полученных с применением таких организмов или содержащих такие организмы (далее - исследование, ГМО, продукция соответственно).
2. Исследование проводится организацией (испытательной лабораторией), аккредитованной в национальной системе аккредитации, с областью аккредитации, соответствующей исследованиям, указанным в настоящей Методике.
3. Результаты исследования ГМО оформляются заключением о результатах исследования, составляемым на основании протоколов испытаний, которое должно содержать:
наименование заключения;
полное наименование и место нахождения организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования;
наименование ГМО с указанием его таксономического статуса;
полное наименование и место нахождения, идентификационный номер налогоплательщика (ИНН) юридического лица, осуществляющего на территории Российской Федерации генно-инженерную деятельность в целях создания ГМО (далее - заявитель ГМО);
полное наименование и место нахождения юридического лица либо фамилия, имя, отчество (при наличии), место жительства индивидуального предпринимателя - изготовителя образцов ГМО;
вид предполагаемого целевого использования ГМО;
место депонирования и коллекционный номер (указывается для депонированных штаммов ГМО);
сведения о трансформационном событии в виде кода, сформированного согласно Общероссийскому классификатору трансформационных событий;
регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации ГМО, предназначенного (предназначенных) для выпуска в окружающую среду, на основе которого (которых) создан ГМО, в отношении которого проведено исследование (в случае если ГМО создан на основе иного (иных) ГМО), либо указание на то, что ГМО не создан на основе иного (иных) ГМО;
регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации ГМО для иного целевого использования (при наличии);
сведения о регистрации ГМО за рубежом (при наличии);
оценку полноты документов и данных, представленных заявителем ГМО для исследования;
краткое содержание документов и данных, представленных заявителем ГМО для исследования;
описание образцов ГМО и исходного организма-реципиента, представленных заявителем ГМО для исследования, с указанием их количества, а также оценку их пригодности для проведения исследования;
выводы о результатах исследования: о молекулярно-генетической структуре ГМО, об отсутствии или наличии не заявленных генетических конструкций; об эффективности метода идентификации ГМО, сведения о соответствии генетической модификации природным (естественным) процессам;
фамилии, имена, отчества (при наличии), должности, места работы, ученые степени (при наличии) лиц, проводивших исследование;
дату и номер заключения;
подпись руководителя организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования.
4. Результаты исследования продукции оформляются заключением о результатах исследования, составляемым на основании протоколов испытаний, которое должно содержать:
наименование заключения;
полное наименование и местонахождение организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования;
наименование продукции;
полное наименование и место нахождения юридического лица, осуществляющего изготовление (поставку) продукции (далее - заявитель продукции);
регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации ГМО, с применением которого получена продукция или который она содержит (указывается регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации каждого ГМО, содержащегося в продукции или с применением, которого она получена);
специальные условия использования ГМО, с применением которого получена продукция или который она содержит (при наличии);
сведения о регистрации продукции за рубежом (при наличии);
компонентный состав продукции, включая информацию о количестве ГМО (доля содержания в %);
оценка полноты представленных на экспертизу документов и данных, представленных заявителем продукции для исследования;
краткое содержание документов и данных, представленных заявителем продукции для исследования;
описание образцов продукции, представленных заявителем продукции для исследования, с указанием их количества, а также оценку их пригодности для проведения исследования;
выводы о наличии или отсутствии заявленного ГМО в образцах продукции;
фамилии, имена, отчества (при наличии), должности, места работы, ученые степени (при наличии) лиц, проводивших исследование;
срок действия свидетельства о государственной регистрации продукции, соответствующий сроку действия свидетельства о государственной регистрации ГМО, с применением которого получена продукция или который она содержит. Если продукция получена с применением нескольких ГМО или содержит несколько ГМО, срок действия свидетельства о государственной регистрации продукции должен соответствовать минимальному сроку действия свидетельства о регистрации ГМО, с применением которого продукция получена или который продукция содержит;
дату и номер заключения;
подпись руководителя организации (испытательной лаборатории), осуществившей проведение исследования.
5. К заключению о результатах исследования ГМО или продукции должны прилагаться протоколы испытаний, на основании которых составлено соответствующее заключение, подписанные лицами, проводившими испытания.
6. Требования к проведению исследования приведены в приложении к настоящей Методике.
7. В случае если заявителем не представлены документы и данные, предусмотренные настоящей Методикой, и (или) образцы ГМО и исходного организма-реципиента или образцы продукции, пригодные для проведения исследований, в количестве, необходимом для проведения исследований, исследование не проводится. Заявителю должен быть выдан мотивированный отказ в проведении исследования, подписанный руководителем организации (испытательной лаборатории), аккредитованной в национальной системе аккредитации, с областью аккредитации, соответствующей исследованиям, указанным в настоящей методике, в которую обратился заявитель для проведения исследования.
II. Исследование ГМО, являющихся микроорганизмами
8. В рамках исследования осуществляется анализ представленных заявителем ГМО документов и данных:
а) наименования ГМО с указанием его таксономического статуса;
б) полного наименования и места нахождения, идентификационного номера налогоплательщика (ИНН) заявителя ГМО;
в) полного наименования и место нахождения юридического лица либо фамилия, имя, отчество (при наличии), место жительства индивидуального предпринимателя - изготовителя образцов ГМО;
г) вид предполагаемого целевого использования ГМО;
д) сведений об исходном организме-реципиенте (таксономическая характеристика с указанием метода идентификации; источник выделения штамма: субстрат, географический пункт, дата выделения; методы идентификации штамма, кем идентифицирован (фамилия, имя, отчество (при наличии)), ссылка на использованные определители);
е) сведений о трансформационном событии в виде кода, сформированного согласно Общероссийскому классификатору трансформационных событий;
ж) информации об организмах-донорах вносимых генов (с указанием группы патогенности при наличии);
з) описания структуры генетической конструкции (внесенной или удаленной) и места ее локализации, характеристики встроенных или измененных генов;
и) информации о генетической модификации: описания метода модификации, структуры вектора, структуры вставки, расположения рекомбинантной ДНК (хромосома, плазмида, мобильные элементы), включая фланкирующие последовательности, включение в состав мобильных генетических элементов;
к) регистрационного номера свидетельства о государственной регистрации ГМО, предназначенного (предназначенных) для выпуска в окружающую среду, на основе которого (которых) создан ГМО, в отношении которого проводится исследование (в случае если ГМО создан на основе иного (иных) ГМО), либо указания на то, что ГМО не создан на основе иного (иных) ГМО;
л) описания методики, позволяющей идентифицировать генетическую модификацию, в том числе описания нуклеотидных последовательностей, используемых праймеров, зондов и условий полимеразной цепной реакции (далее - ПЦР);
м) информации о месте депонирования и коллекционном номере штамма ГМО, паспорт штамма ГМО (для депонированных штаммов ГМО) либо информации о культурально-морфологических, физиолого-биохимических (ферментативных), антигенных, биологических свойствах и генетических особенностях штамма ГМО; об условиях культивирования: наименованиях питательных сред, pH среды, температуре и продолжительности выращивания, сроке хранения и периодичности пересева культуры штамма ГМО в нативной форме; о применяемом способе и условиях хранения штамма ГМО: в случае лиофилизации указывается продолжительность выращивания на питательной среде (возраст культуры), состав защитной среды, титр клеточной суспензии, режим высушивания, температура хранения, срок хранения; в случае криоконсервации указывается продолжительность выращивания на питательной среде (возраст культуры), состав защитной среды, титр клеточной суспензии, скорость замораживания (град/мин), температура хранения, срок хранения; о диссоциации культуры в зависимости от метода хранения (описание морфологических типов колоний на конкретной среде с подробным описанием типа колонии, сохраняющего полезный или диагностический признак); о среде, на которой заявителем предоставляется штамм ГМО; о количестве, дате приготовления и сроке годности образцов штамма ГМО (в случае непредоставления информации о месте депонирования и коллекционном номере штамма ГМО, паспорта штамма ГМО);
н) регистрационного номера свидетельства о государственной регистрации ГМО для иного целевого использования (при наличии);
о) информации о регистрации ГМО за рубежом (при наличии);
п) данных полногеномного секвенирования ГМО (при наличии).
Заявителем ГМО для исследования предоставляются образцы ГМО и исходного организма-реципиента.
9. В рамках исследования осуществляются следующие испытания представленных заявителем образцов ГМО и исходного организма-реципиента:
а) проверка (валидация) методики идентификации ГМО, в том числе оценка чувствительности и специфичности данной методики в соответствии с критериями эффективности, указанными в таблице N 3 приложения к настоящей Методике;
б) подтверждение присутствия (отсутствия) заявленной генетической модификации в геноме ГМО;
в) подтверждение присутствия (отсутствия) маркерных и селективных генов в геноме ГМО, указанных в таблице N 1 приложения к настоящей Методике;
г) проведение полногеномного секвенирования ГМО, который содержится в продукции в жизнеспособном виде (в случае непредставления заявителем ГМО данных полногеномного секвенирования ГМО, представляющего собой плазмиду, бактерию, одноклеточное простейшее, животное, гриб), проведенного с использованием методики полногеномного секвенирования, соответствующей критериям эффективности, указанным в таблице N 4 приложения к настоящей Методике.
10. Полногеномное секвенирование ГМО проводится с использованием методики полногеномного секвенирования, соответствующей критериям эффективности, указанным в таблице N 4 приложения к настоящей Методике.
III. Исследование ГМО растительного происхождения
11. В рамках исследования осуществляется анализ представленных заявителем ГМО документов и данных, предусмотренных подпунктами "а" - "л" пункта 8 настоящей Методики, а также данных секвенирования вставки ГМО и бордерных последовательностей, не менее 100 нуклеотидов по флангам генома реципиента (при наличии).
Заявителем ГМО для исследования предоставляются образцы ГМО и исходного организма-реципиента.
12. В рамках исследования осуществляются следующие испытания представленных заявителем образцов ГМО и исходного организма-реципиента:
а) проверка (валидация) методики идентификации ГМО, в том числе оценка чувствительности и специфичности данной методики в соответствии с критериями эффективности, указанными в таблице N 3 приложения к настоящей Методике;
б) подтверждение присутствия (отсутствия) заявленной генетической модификации в геноме ГМО;
в) подтверждение присутствия (отсутствия) генетических последовательностей в геноме ГМО, указанных в таблице N 2 приложения к настоящей Методике.
IV. Исследование ГМО животного происхождения
13. В рамках исследования осуществляется анализ представленных заявителем ГМО документов и данных, предусмотренных подпунктами "а" - "л" пункта 8 настоящей Методики, а также данных секвенирования вставки ГМО и бордерных последовательностей, не менее 100 нуклеотидов по флангам генома реципиента (при наличии).
Заявителем ГМО для исследования предоставляются образцы ГМО и исходного организма-реципиента.
14. В рамках исследования осуществляются следующие испытания представленных заявителем образцов ГМО и исходного организма-реципиента:
а) проверка (валидация) методики идентификации ГМО, в том числе оценка чувствительности и специфичности данной методики в соответствии с критериями эффективности, указанными в таблице N 3 приложения к настоящей Методике;
б) подтверждение присутствия (отсутствия) заявленной генетической модификации в геноме ГМО;
в) подтверждение присутствия (отсутствия) незаявленных генетических последовательностей в геноме ГМО.
V. Исследование продукции
15. В рамках исследования осуществляется анализ представленных заявителем продукции документов и данных:
а) наименования продукции;
б) полного наименования и места нахождения заявителя продукции;
в) регистрационного номера свидетельства о государственной регистрации ГМО, с применением которого получена продукция или который она содержит (указывается регистрационный номер свидетельства о государственной регистрации каждого ГМО, содержащегося в продукции или с применением, которого она получена);
г) компонентного состава продукции, включая информацию о количестве ГМО (доля содержания в %);
д) описания методики, позволяющей идентифицировать генетическую модификацию, в том числе описание нуклеотидных последовательностей, используемых праймеров, зондов, и условий ПЦР;
е) специальных условий использования ГМО, с применением которого получена продукция или который она содержит (при наличии);
ж) информации о регистрации продукции за рубежом (при наличии).
Заявителем продукции для исследования предоставляются образцы продукции.
16. В рамках исследования осуществляются следующие испытания представленных заявителем образцов продукции:
а) проведение идентификации заявленного (заявленных) ГМО в образцах продукции;
б) проведение скрининга для подтверждения присутствия заявленных генетических модификаций в образцах продукции.
Приложение
к Методике производства
молекулярно-генетического исследования
генно-инженерно-модифицированных
организмов, используемых для производства
кормов и кормовых добавок для животных,
а также кормов и кормовых добавок
для животных, полученных с применением
таких организмов или содержащих
такие организмы
Таблица N 1. Основные маркерные и селективные гены,
являющиеся составляющими частями генно-инженерных
конструкций микроорганизмов
|
Мишень
|
Описание
|
|
Ген LacZ
|
Кодирует фермент b-галактозидазу. Используется в векторных плазмидных конструкциях (pCR2.1TOPO, pVIK112, pBSKSII), включает область полилинкера для клонирования рекомбинантных генов. При наличии данного фермента бесцветный субстрат X-gal превращается в окрашенный продукт, бактериальные колонии, экспрессирующие LacZ, имеют голубой цвет
|
|
Ген gfp
|
Ген зеленого флуоресцентного белка используется в ряде векторных плазмид для генно-инженерных манипуляций (pKEN-gfpmut2, pRK415-gfp) в качестве светящейся метки
|
|
Ген amp
|
Кодирует устойчивость к ампициллину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pBR322, pUC18, pBSKSII, pET, pCR2.1 TOPO)
|
|
Ген Km
|
Кодирует устойчивость к канамицину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pVIK112, pMC212)
|
|
Ген tetO
|
Кодирует устойчивость к тетрациклину, используется в ряде векторных плазмид для селекции по антибиотикоустойчивости (pBR322)
|
|
F1 ori
|
Ориджин репликации плазмид (pBSKSII, pKEN-gfpmut2, pCR2.1 TOPO)
|
|
Транспозон Tn7L
|
Фрагмент обеспечивает транспозицию рекомбинантных генов из плазмид в геном (pRK415-gfp)
|
|
Ген ermC
|
Кодирует устойчивость к эритромицину, плазмидные вектора
|
|
Ген cat
|
Кодирует устойчивость к хлорамфениколу, плазмидные вектора
|
|
R6K ori
|
Ориджин репликации плазмид (pVIK112)
|
Таблица N 2. Основные генетические последовательности
в геноме ГМО растительного происхождения
|
ПЦР мишень
|
ГМ линии сои, кукурузы и рапса, содержащие данный элемент
|
|
Промотор p-CaMV35S
|
GTS 40-3-2, A2704-12, A5547-127, BT 176, BT11, MON810, GA21, MON88017, NK603, MON863, T25, T45
|
|
Терминатор t-NOS
|
GTS 40-3-2, MON863, MON531, MON757, MON1076, MON1445, MON1698, MON15985, BT11, GA21, NK603, MON802, 3272, MIR604, MON88017
|
|
Промотор p-FMV
|
MON89788, MON89034, GT73
|
|
Промотор p-SSuAra
|
MS1, RF1, RF2, MS8xRF3
|
|
Промотор p-TA29
|
MS1, RF1, RF2, MS8xRF3
|
|
Промотор p-NOS
|
MS1, RF1, RF2, Topas 19-2
|
|
Терминатор t-E9
|
MON89788
|
|
Терминатор t-35S
|
BT 176, T14, T25, 3272, A2704-12, A5547-127, T45, Topas19/2
|
|
Терминатор t-OCS
|
MS1, RF1, RF2
|
|
Терминатор t-g7
|
MS1, RF1, RF2, MS8xRF3
|
|
Ген pat
|
TC1507, 59122 A2704-12, A5547-127, T25, T45, Bt11, DAS-59132-8, 281-24-236 Topas 19/2, DAS-44406-6, SYHT0H2, MZHG0JG, MON 87419
|
Выявление регуляторных элементов и целевых генов, используемых для получения ГМО растительного происхождения, осуществляется в соответствии с национальными и (или) межгосударственными стандартами, действующими в Российской Федерации.
Таблица N 3. Критерии эффективности методики
идентификации ГМО
|
N п/п
|
Характеристика
|
Описание характеристики
|
Критерий
|
Методы оценки критерия
|
|
1
|
Специфичность ПЦР
|
Способность ПЦР тест-системы выявлять только целевую ДНК
|
ПЦР тест-система должна выявлять целевую ДНК.
ПЦР тест-система не должна давать ложноположительных результатов, в том числе выявлять ДНК близкородственных и неродственных биологических видов, в 100% проводимых исследований
|
Для оценки специфичности используют контрольные панели образцов. В состав панели входят образцы, содержащие целевую ДНК и не содержащие целевую ДНК
|
|
2
|
Чувствительность ПЦР
|
Наименьшее содержание копий целевой ДНК, которое может быть определено с использованием данной ПЦР методики, в первую очередь, зависит от свойств используемых праймеров и зондов
|
Чувствительность должна быть не ниже 100 копий целевой ДНК, например, плазмидной, в одной ПЦР реакции
|
Проводят исследования ряда десятикратных разведений целевой плазмидной ДНК с известной концентрацией в двух повторах каждое. Определяют максимальное разведение, при котором ДНК воспроизводимо выявляется (в двух повторах)
|
|
3
|
Эффективность ПЦР
|
Характеризует прирост матрицы на каждом цикле амплификации
|
Эффективность ПЦР должна быть не ниже 90%.
Это соответствует значению наклона линейной области зависимости Ct от логарифма концентрации ДНК матрицы (slope): не ниже - 3,6 (приемлем диапазон slope 3,1 - 3,6)
|
Для оценки эффективности ПЦР проводят амплификацию с рядом десятикратных разведений целевой плазмидной ДНК (пункт 2 настоящей таблицы) в двух повторах каждое.
По результатам амплификации строят график зависимости Ct от логарифма концентрации ДНК матрицы. Определяют наклон линейной области (slope). Эффективность ПЦР оценивают по уравнению:
E = [10 (- 1 / slope)] - 1, в идеальном случае - при удвоении количества ПЦР продукта за один цикл: E = 100%, (slope = -3,32)
|
|
4
|
Предел обнаружения ПЦР-тест системы (LOD)
|
Отражает минимальное количество биологического искомого объекта в исследуемом образце, которое может достоверно обнаружить данный метод
|
Чем меньше искомого биологического объекта способен выявить метод, тем выше его чувствительность. Определяется экспериментально, но должен составлять не более 0,1%
|
Готовят ряд модельных образцов с разным содержанием целевой матрицы. Готовят образцы целевого ГМО ингредиента (от 5% до 0,001% содержания) в соответствующей матрице. Исследуют приготовленную панель с использованием ПЦР методики. Определяют минимальное содержание ГМО ингредиента в тотальной ДНК организма, при котором ГМО воспроизводимо выявляется (в десяти повторах)
|
|
5
|
Предел количественного определения (LOQ, quantitation limit)
|
Наименьшее количество (концентрация) вещества в образце, которое может быть количественно оценено с использованием методики с требуемой правильностью и внутрилабораторной прецизионностью
|
Предел должен быть не более 0,1%.
На пределе чувствительности относительное стандартное отклонение (RSD) не должно превышать 20%.
Истинное значение измеряемой величины должно входить в полученный при измерениях доверительный интервал
|
Исследуют 10 повторов 0,1% ГМО стандарта по ПЦР методике. Рассчитывают среднее значение содержания ГМО в образце и относительное стандартное отклонение (RSD). Сравнивают рассчитанное стандартное отклонение (RSD) с критерием 20%. Также оценивают, входит ли истинное значение в доверительный интервал полученного среднего значения
|
|
6
|
Аналитическая область (dynamic range)
|
Интервал определяемых аналитических характеристик, в котором получаемые результаты имеют приемлемый уровень правильности и прецизионности, приемлем диапазон 0,1% - 5%
|
Диапазон 0,1% - 5% ГМО экспериментальных данных, должен удовлетворять линейной модели (пункт 7 настоящей таблицы)
|
Проводят исследования образцов с различным содержанием ГМО. Оценивают линейность зависимости аналитического сигнала
|
|
7
|
Линейность
|
Наличие линейной зависимости аналитического сигнала в анализируемой пробе в пределах аналитической области методики. Оценивается как R2 коэффициент корреляции, определяющий верность модели линейной зависимости Ct от логарифма концентрации калибровочных образцов
|
R2 коэффициент для калибровочных образцов должен быть не менее 0,98%
|
Исследуют в двух повторах 0,1%, 1,0% и 5% калибровочные ГМО стандарты по ПЦР методике. Строят калибровочную прямую (dCt от lgC), оценивают коэффициент корреляции данных с линейной зависимостью (R2)
|
|
8
|
Правильность
|
Правильность методики характеризуется отклонением среднего результата определений, выполненных с ее использованием, от значения, принимаемого за истинное
|
Методика дает корректные результаты, если значения, принимаемые за истинные, лежат внутри доверительных интервалов соответствующих средних результатов анализов, полученных экспериментально по данной методике
|
Готовят образцы из калибровочных стандартов 0,1%, 1,0% и 5% с добавлением матриц различного происхождения (для этого смешивают стандарты с другими ингредиентами, сухим молоком, мясным фаршем, рыбной мукой). Исследуют образцы по ПЦР методике в двух повторах. Оценивают, входит ли истинное значение в диапазон погрешности полученного среднего значения для каждого образца
|
При использовании методики, основанной на ПЦР, исследование включает последовательные процессы: подготовку проб, выделение нуклеиновых кислот из образцов, амплификацию заданных фрагментов нуклеиновых кислот, детекцию продуктов амплификации, анализ и интерпретацию результат.
Таблица N 4. Критерии эффективности методики
полногеномного секвенирования
|
Этап анализа
|
Характеристика
|
Описание характеристики
|
Критерий
|
|
Подготовка библиотеки для секвенирования
|
Концентрация геномной ДНК
|
не менее 0,2 нг/мкл
|
|
|
Размер фрагментов ДНК
|
Распределение фрагментов по длинам, устанавливается электрофоретически (например, на капиллярных анализаторах)
|
распределение в диапазоне 250 - 1000 п.н. Максимум распределения 300 - 500 п.н.
|
|
|
Проведение массового параллельного секвенирования
|
Распределение качества идентификации нуклеотидов
|
Q = -10log10p, где
p - вероятность неправильного определения нуклеотида
|
Q > 20, то есть вероятность ошибки не более 0,01
|
|
Среднее качество прочтения
|
Q > 25
|
||
|
Служебные последовательности
|
Наличие служебных последовательностей (адаптеров, индексов) в прочтении
|
должны отсутствовать
|
|
|
Покрытие чтения
|
число чтений, содержащих определенный нуклеотид последовательности генома
|
не менее десятикратного покрытия
|
|
|
Представленность нуклеотидов в каждом цикле
|
Максимальное отклонение между A и T или G и C
|
не более 20% в любой позиции
|
|
|
GC-состав на прочтение
|
Сумма отклонений от ожидаемого распределения
|
не более 30% прочтений
|